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本制品是一类预活化树脂，其纯化原理在于可以通过与巯基或者氨基的反应实现抗原的固定化，进而利用抗原抗体的特异性反应对免疫血清中的抗体进行高效纯化，是多克隆抗体生产中不可缺少的纯化介质。

• SulfoLink Coupling Agarose Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
  
• 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 含巯基抗原的偶联流程
  
  • 缓冲液准备
    所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
    偶联液：50mM Tris，5mM EDTA-Na，pH8.5
    封闭液：50mM Tris，5mM EDTA-Na，50mM L-半胱氨酸，pH8.5
    保护液：20mM PBS，20%乙醇，pH8.0
    结合/洗杂液：20mM PBS，pH8.0
    洗脱液：100mM甘氨酸，pH2.5～3.0
    中和液：1M Tris-HCl，pH8.5
    
  • 抗原准备
    使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为1～3mg/mL的抗原溶液。建议该溶液现用现配，储存时间过长会影响偶联效果。
    注：
    ① 抗原样品使用前务必确保其巯基处于还原状态(可以使用DTNB(Ellman's Reagent)检测自由巯基的含量)。如果巯基已经氧化，必须对抗原进行还原，一般推荐使用还原剂TCEP(货号：SY0361)，TCEP溶液很稳定，可以选择性的、高效的打开抗原中的二硫键，并且不影响抗原与树脂的偶联反应，每毫克抗原中TCEP的添加量不超过12mg，具体使用量需要自行优化。
    ② 如果使用DTT等含有巯基的还原剂，处理完样品必须要将还原剂去除，否则会影响抗原与树脂的偶联效率。
    
  • 抗原偶联
    
    • 取适量SulfoLink Coupling Agarose Resin，加入到合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。
      
    • 关闭柱子的下端出口，加入等体积的含巯基的抗原，混匀，取出至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
      注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
      
    • 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出液，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出液。
      注：如有需要，可以使用Ellman’s Reagent检测其中巯基含量，得出抗原残留量，从而计算偶联效率。
      
    • 关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，转移至合适的离心管中，于28℃震荡孵育30min。
      
    • 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
      注：如果立即使用，可以参考【抗体纯化】操作。如果以后使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于4℃冰箱保存。
  • 抗体纯化
    
    • 将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
      
    • 将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5～1mL/min，并收集流出液。
      
    • 用10～15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
      
    • 使用5～10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
      注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH7.0～8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
      
    • 依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
• 含氨基抗原偶联流程
  
  • 缓冲液准备
    所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
    偶联液：0.1M NaHCO3，0.5M NaCl，pH8.5
    封闭液：50mM Tris，5mM EDTA-Na，50mM L-半胱氨酸，pH8.5
    保护液：20mM PBS，20%乙醇，pH8.0
    结合/洗杂液：20mM PBS，pH8.0
    洗脱液：100mM甘氨酸，pH2.5～3.0
    中和液：1M Tris-HCl，pH8.5
    
  • 抗原偶联
    
    • 使用偶联液溶解抗原，制备成终浓度为5～10mg/mL的抗原溶液。
      
    • 取适量SulfoLink Coupling Agarose Resin，加入到合适的重力柱中，靠重力流干保护液，用3倍柱体积的偶联液平衡树脂，待偶联液流干，再加入3倍柱体积的偶联液，重复操作2遍。共使用9倍柱体积的偶联液。
      
    • 关闭柱子的下端出口，加入等体积的含氨基的抗原，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育3-5h，或者4℃震荡孵育过夜(12-15h)。
      注：确保树脂充分悬浮起来，否则将大大影响偶联效率。
      
    • 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，收集流出液，再用3倍柱体积的偶联液清洗树脂，合并两次流出，待测试。
      
    • 关闭柱子的下端出口，加入等体积的封闭液，混匀，取出转移至合适的离心管中，置于28℃震荡孵育30min。
      
    • 将上述反应体系取出，转移至重力柱中，流干其中的封闭液。
      注：如果暂不使用，可以用3倍柱体积的结合液清洗树脂，然后保存在等体积的保护液中，于4℃保存。
  • 抗体纯化
    
    • 将偶联了抗原的树脂装入合适的层析柱，用5倍柱体积的结合液进行平衡，使填料处于与抗体更易结合环境中，一方面保护目标抗体，另一方面提高抗体结合效率。
      
    • 将含有抗体的样品加到平衡好树脂中，为了保证抗体与树脂充分接触，提高目标抗体的回收率，可以控制上样流速在0.5～1mL/min，并收集流出液。
      
    • 用10～15倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，提高目的抗体的纯度，收集洗杂液。
      
    • 使用5～10倍柱体积的洗脱液，收集洗脱组分，即目的抗体。
      注：为了保持抗体活性，需要立即将洗脱组分透析至pH7.0～8.0的缓冲液中，或者先加入1/10倍洗脱组分体积的中和液，将洗脱组分进行中和，再透析。
      
    • 依次使用3倍柱体积的结合液和5倍柱体积的去离子水平衡树脂，最后再用5倍柱体积的保护液平衡，然后保存在等体积的保护液中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。
• SDS-PAGE检测
  将纯化抗体样品得到的流出组分、洗杂组分和洗脱组分以及原始含抗体样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。